Основные сведения о диагностике ВИЧ-инфекции

Фундаментом лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции служат скрининговые тесты на ВИЧ. Реактивный результат скринингового теста должен быть обязательно подтвержден другим методом (подтверждающий тест). Для скрининговой диагностики ВИЧ-инфекции следует пользоваться тест-системами 4-го поколения («Combo test»), которые одновременно выявляют как антитела к ВИЧ, так и антиген p24, и обладают относительно высокой чувствительностью (Breast, 2000; Weber, 2002; Sickinger, 2004; Skidmore, 2009). «Серонегативные» случаи хронической ВИЧ-инфекции встречаются крайне редко и в практической работе ими можно пренебречь (Spivak, 2010). Все одобренные к применению скрининговые тест-системы выявляют ВИЧ всех известных типов (ВИЧ-1 и ВИЧ-2), групп и подтипов.

В продаже есть множество тест-систем для скрининговой диагностики ВИЧ-инфекции, однако в основе их работы лежит один и тот же принцип — образование комплексов антиген-антитело. Прототипом всех тест-систем послужила технология ELISA (технология твердофазного имму-ноферментного анализа). Ее основной элемент — пластиковая плашка с 96 лунками (микро-титровальная плашка). На поверхность каждой лунки нанесены антигены ВИЧ и антитела к ВИЧ. Когда сыворотка или плазма крови пациента, в которой содержатся антитела к ВИЧ, попадает в лунку, антитела связываются с нанесенными на поверхность лунки антигенами ВИЧ. Затем в лунку добавляют меченные ферментом антитела, распознающие человеческие антитела и связывающиеся с ними. Наконец, добавляется субстрат для фермента, которым помечены антитела к человеческим антителам. В результате взаимодействия фермента с субстратом раствор меняет цвет. Степень изменения цвета определяют фотометрическим методом. Оптическая плотность коррелирует с концентрацией антител к ВИЧ — чем выше интенсивность окраски, тем больше антител содержится в образце сыворотки (плазмы) крови пациента. Эта технология была улучшена с целью повышения результативности и эффективности скри-нинговых тестов (Perry, 2008). Процесс работы с современными тест-системами практически полностью автоматизирован, что обеспечивает высокую степень стандартизации и позволяет получить результат менее чем за час. В этих системах твердая фаза представляет собой микрочастицы с нанесенными антигенами вируса и антителами к вирусу. Поэтому метод получил название «иммуноферментный анализ на микрочастицах» (ИФАМ).

Получаемый результат обычно представляет собой величину, не имеющую единицы измерения, вычисляемую как отношение оптической плотности образца биологического материала пациента к оптической плотности отрицательного контроля (образец/контроль, О/К). Если отношение меньше 1, то результат исследования интерпретируют как «отрицательный», если же оно больше 1, то результат интерпретируют как «реактивный». Такой результат скринингового теста следует называть «реактивным», а не «положительным», поскольку он нуждается в подтверждении другим методом.

Для скрининговой диагностики предпочтительнее использовать тест-системы с максимальной чувствительностью (чтобы не пропустить ни одного случая инфицирования), в то время как для подтверждающего теста в первую очередь важна высокая специфичность метода. Одобренные к применению в Германии скрининговые тест-системы обладают специфичностью в 99,5%. Это значит, что при исследовании 200 ВИЧ-отрицательных образцов в одном случае может быть получен ложнореактивный результат. Ложнореактивные результаты могут наблюдаться в том числе на фоне стимуляции иммунной системы разными факторами (например, при вирусных инфекциях, на фоне беременности, после вакцинации, при аутоиммунных заболеваниях). Поэтому у пациентов из определенных групп (беременных или получающих диализ) выше вероятность получения ложнореактивного результата теста на ВИЧ.

Для подтверждения реактивного результата скринингового теста обычно применяется метод иммуноблоттинга (вестерн блот). Вирусные белки (антигены) разделяются по молекулярному весу электрофорезом и переносятся на мембрану, которая затем используется в качестве тест-полоски. Сейчас появилась улучшенная технология блоттинга, которая легче поддается стандартизации — так называемый линейный блот. В этом методе на тестовую полоску (мембрану) наносят рекомбинантные антигены ВИЧ, поэтому предварительный электрофорез не требуется. Тест-полоска инкубируется с сывороткой или плазмой крови пациента. При наличии в ней антител к ВИЧ они связываются с антигенами. Аналогично методу ИФА (ELISA) (см. выше) образовавшиеся комплексы антиген-антитело проявляются на тест-полоске с помощью меченных ферментом антител к человеческим антителам и добавления соответствующего субстрата для ферментативной реакции. В соответствии со специфичностью содержащихся в образце антител на тест-полоске появляются определенные сочетания полос.

Белки ВИЧ подразделяются на три функциональные группы («p» — белок, «gp» — гликопро-теин; числа соответствуют молекулярному весу):

• белки оболочки (env): gp41, gp160, gp120

• белки полимеразы (pol): p31/p34, p39/p40, p51/p52, p66/p68

• белки ядра (gag): p17/p18, p24/p25, p55

Образование антител после инфицирования подчиняется определенным закономерностям: антитела к p24 и gp120 определяются рано, в то время как полоска, соответствующая наличию антител к p31, появляется позже (Fiebig, 2003). Результат вестерн блота расценивается как положительный при обнаружении не менее двух или трех полос. Единые международные критерии положительного результата по специфичности антител отсутствуют. Согласно немецким рекомендациям, основывающимся на нормативе 58 969 часть 41 Немецкого нормативного института (DIN 58 969 Part 41) («серодиагностика инфекционных болезней методом иммуноблоттинга»), результат анализа следует интерпретировать как положительный, если выявлены антитела к белку env, а также антитела к белку gag и/или к белку pol. По критериям ВОЗ результат вестерн блота положителен, если выявлены антитела не менее чем к двум белкам env. «Американский красный крест» определяет положительный результат как наличие антител не менее чем к одному белку из каждой группы (gag, pol и env). Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) рекомендует расценивать результат как положительный только при наличии полос, соответствующих белкам p24, p34 и gp41 или gp120/160. Например, при обнаружении двух полос, соответствующих gp120 и p24, по критериям ВОЗ результат следует интерпретировать как сомнительный, а по немецким критериям как положительный. Слабое окрашивание полос может указывать на раннюю фазу ВИЧ-инфекции; в этом случае необходимо уточнить диагноз другими методами, например, с помощью ПЦР (см. ниже). По сравнению с тест-системами 4-го поколения определение антигена p24 не входит в подтверждающий анализ. В случае получения реактивного результата скринингового теста и отрицательного результата подтверждающего теста нельзя исключить острую ВИЧ-инфекцию, при которой ВИЧ-специфические антитела еще не достигли диагностического титра, а антиген p24 уже определяется в крови. В такой ситуации следует повторить тестирование на ВИЧ через 2— 3 недели. При подозрении на острую ВИЧ-инфекцию (острый ретровирусный синдром, недавний опасный контакт с биологическими жидкостями ВИЧ-инфицированного) полезно сделать ПЦР на ВИЧ. ПЦР также рекомендуется выполнять в случаях высокореактивного результата скринингового теста и отрицательного результата подтверждающего теста. В подобных случаях рекомендуется консультироваться с сотрудниками лаборатории для составления наиболее подходящего плана лабораторного обследования.

В идеале лаборатория должна выполнять вестерн блот, в котором также предусмотрена возможность выявления антител к ВИЧ-2. Как правило, для этой цели используется синтетический белок ВИЧ-2. В случае обнаружения реактивной полосы, соответствующей белку ВИЧ-2, результат следует подтвердить с помощью ВИЧ-2-специфического вестерн блота. В качестве альтернативы вестерн блоту для подтверждения реактивного результата скринингового теста может применяться менее распространенный метод иммунофлюоресценции.

Для того чтобы исключить возможность использования по ошибке чужого образца, второй тест для подтверждения положительного результата скринингового теста проводят только с новым образцом крови. Если у пациента предполагается наличие ВИЧ-инфекции, подтвердить диагноз можно результатом измерения вирусной нагрузки (см. раздел 6.11 «Лабораторное наблюдение за течением ВИЧ-инфекции»). В этом случае в повторном серологическом тесте нет необходимости.

Помимо серологических тест-систем, применяются молекулярные методы обнаружения вирусной РНК, такие, как ПЦР на ВИЧ. Количественное определение РНК ВИЧ (определение вирусной нагрузки) — одна из основных составляющих лабораторного наблюдения за течением ВИЧ-инфекции (Berger, 2002; Wittek, 2007).

Однако при установлении первичного диагноза ВИЧ-инфекции применение ПЦР на ВИЧ ограничено только определенными клиническими ситуациями, например, эта методика может применяться при подозрении на острую инфекцию или вертикальную передачу ВИЧ (см. ниже). В общем случае для исключения ВИЧ-инфекции метод ПЦР пригоден лишь условно и не может заменить серологический тест на ВИЧ. Кроме того, имеющиеся в продаже тест-системы еще не валидированы производителями для первичной диагностики ВИЧ-инфекции.

Экспресс-тесты

Экспресс-тесты выполняют ту же функцию, что и обычные скрининговые тесты на ВИЧ, т. е. реактивные результаты должны подтверждаться с помощью вестерн блота. Экспресс-тесты выполняются быстро, они просты в использовании и не требуют затрат на дополнительное оборудование, поэтому они могут применяться вне лабораторий, непосредственно «на месте оказания помощи». Помимо плазмы и сыворотки крови можно исследовать цельную или капиллярную кровь (из подушечки пальца или мочки уха), тем самым в предварительном центрифугировании крови нет необходимости. Некоторые тест-системы позволяют исследовать мочу или транссудат ротовой полости (не слюну). Тем не менее, специфичность экспресс-тестов с образцами сыворотки или плазмы крови выше, чем с образцами любых других биологических жидкостей (Pavie, 2010). Результаты получают через 15—30 минут. Большинство экспресс-тестов основано на методе иммунохроматографии. Кроме того, выпускаются экспресс-тесты, основанные на методе агглютинации частиц, модифицированном методе ИФА — иммунодоте (Im-munoDOT) и методе иммунофильтрации (Giles, 1999; Branson, 2003; Greenwald, 2006). Почти все существующие на сегодняшний день экспресс-тесты способны выявлять только антитела к ВИЧ, но не антиген p24, что соответствует устаревшим скрининговым тест-системам 3-го поколения. В 2009 г. впервые был сертифицирован экспресс-тест 4-го поколения (Determine HIV-1 /2 Ag/Ab Combo, производства компании Inverness Medical), который позволяет выявить наличие антител к ВИЧ и антигена p24 по отдельности. Однако результаты сравнительного исследования показали, что этот экспресс-тест плохо выявляет случаи первичной ВИЧ-инфекции. При исследовании образцов, взятых у пациентов с острой ВИЧ-инфекцией, в трети случаев были получены ложноотрицательные результаты. Реактивность этого экспресс-теста запаздывала на неделю по сравнению с референсным тестом (Mohrmann, 2009).

Возможность экспресс-диагностики ВИЧ-инфекции особенно важна в ситуациях, когда необходимо немедленно определиться с дальнейшей тактикой, например, перед экстренными хирургическими вмешательствами или после укола иглой. Кроме того, экспресс-тест незаменим при обследовании поступающих в клинику рожениц с неизвестным ВИЧ-статусом. Однако при этом также следует связаться с обслуживающей клинику лабораторией и указать на необходимость получения быстрого результата стандартного тестирования на ВИЧ. При необходимости результат стандартного тестирования на ВИЧ можно получить уже через час после доставки образца крови в лабораторию. Экспресс-тесты также служат хорошим подспорьем в странах с недостаточно развитой инфраструктурой здравоохранения (WHO, 1998, 2004) и для обследования некоторых групп населения, которые иначе не прошли бы обследование на ВИЧ. К результату экспресс-теста следует относиться только как к предварительному, и при первой возможности его необходимо подтвердить результатами стандартного теста на ВИЧ, проводящегося в лаборатории. Результаты исследований показали, что чувствительность некоторых экспресс-тестов ниже по сравнению со стандартными тестами на ВИЧ. В одном исследовании, проведенном в Кейптауне (ЮАР), у существенной доли ВИЧ-инфицированных детей были получены ложноотрицательные результаты экспресс-тестов (Claassen, 2006).

Диагностическое «окно»

«Диагностический провал» или «диагностическое окно» — период от момента заражения ВИЧ до момента, когда уровень биохимических маркеров ВИЧ-инфекции (антител, антигенов и (или) нуклеиновых кислот) становится выше порога обнаружения (Busch, 1997).

Образование антител к ВИЧ начинается не ранее, чем через две недели после заражения. Специфические антитела к ВИЧ обнаруживаются через 4 недели в 60—65% случаев, через 6 недель в 80% случаев, через 8 недель в 90% случаев, и через 12 недель в 95% случаев. Диагностические тест-системы 4-го поколения сужают диагностическое окно, поскольку они способны одновременно выявлять антиген p24 (Gürtler, 1998; Ly, 2001). Антиген p24 обнаруживается приблизительно за 5 дней до сероконверсии (первого появления специфических антител). Наиболее ранний маркер ВИЧ-инфекции — РНК ВИЧ — можно обнаружить примерно на 7 дней раньше, чем антиген p24 (Fiebig, 2003). Во многих случаях РНК ВИЧ можно обнаружить на второй неделе после заражения. Тем не менее, отрицательный результат тестирования в это время не исключает ВИЧ-инфекцию. Отрицательный результат скринингового тестирования на ВИЧ свидетельствует об отсутствии антител к ВИЧ и антигена p24 на момент тестирования. Тем не менее, степень доверия к такому результату зависит главным образом от времени, прошедшего с момента возможного заражения. Из этого следует несколько важных выводов:

1. Проводить тестирование на ВИЧ сразу после возможного заражения нецелесообразно, поскольку антитела к ВИЧ еще не появились. По этой причине тестирование на ВИЧ следует проводить не раньше третьей недели от момента опасного контакта. Исключение: необходимость официального подтверждения отсутствия ВИЧ-инфекции у пострадавшего на момент опасного контакта с ВИЧ (например, в случае укола иглой при выполнении медицинских манипуляций).

2. В течение трех месяцев с момента возможного заражения отрицательные результаты тестов на ВИЧ не позволяют полностью исключить наличие ВИЧ-инфекции. Тестирование на ВИЧ следует проводить через 2 и 6 недель, а также через 3 месяца после возможного заражения. Дополнительное тестирование на ВИЧ (через 6 месяцев) проводится только в особых случаях, например, при подозрении на острый ретровирусный синдром.

3. Отрицательному результату тестирования на ВИЧ можно доверять только в случае, если тестирование было проведено не менее чем через три месяца, начиная с момента опасного контакта с ВИЧ, при этом в течение трех месяцев, предшествующих данному тестированию, не было повторного опасного контакта с ВИЧ.

Диагностика ВИЧ-инфекции у новорожденных

У детей, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями, до 18-месячного возраста в крови могут определяться материнские антитела к ВИЧ (Moodley, 1997; European collaborative study, 1991). Эти антитела проникают в кровь плода через плаценту, начиная с 32-й недели беременности, но не выполняют никакой защитной функции. По этой причине для подтверждения или исключения факта вертикальной передачи ВИЧ бесполезно проводить серологическое тестирование на ВИЧ, поскольку в любом случае будет получен положительный результат.

Согласно германо-австрийским рекомендациям 2008 г. по лечению ВИЧ-инфекции у беременных и детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, для исключения вертикальной передачи ВИЧ требуется не менее двух отрицательных результатов ПЦР. Первую ПЦР на ВИЧ необходимо выполнить после первого месяца жизни (чувствительность 96%, специфичность 99%), затем еще раз после исполнения трех месяцев, поскольку в этом возрасте чувствительность и специфичность ПЦР на ВИЧ достигают почти 100%. Необходимо подчеркнуть, что вертикальную передачу ВИЧ можно исключить только в случае отсутствия риска заражения ребенка после родов через грудное вскармливание.

Даже при получении отрицательных результатов ПЦР на ВИЧ необходимо хотя бы однократно получить результат анализа, свидетельствующего об исчезновении материнских антител. В случае получения положительного результата необходимо повторить тестирование на ВИЧ с другим образцом крови.


Пчела #52 (июнь 2012)



 



Перейти на главную История создания журнала Адресная книга взаимопомощи Об интересных местах Об интересных людях Времена Многонациональный Петербург Клубы и музыка Прямая речь Экология Исторический материализм Метафизика Политика Правые Левые Благотворительность и третий сектор Местное самоуправление Маргиналии Дети и молодежь Наркозависимые Бывшие заключенные Глухие Слепые Люди в кризисной ситуации Душевнобольные Алкоголики Инвалиды-опорники

© 1996-2013 Pchela

Письмо в "Пчелу"